Laporan
Praktikum Biokimia
I. Tujuan
a. Dapat mengetahui dan memahami tehnik
pemisahan dengan metode kromatografi lapis tipis.
b. Dapat menentukan Rf komponen –
komponen yang dipisahkan dan mengidentifikasi zat yang dipisahkan
II. Dasar
Teori
Kromatografi adalah suatu cara pemisahan dimana
komponen-komponen yang dipisahkan didistribusikan antara 2 fase,salah satunya
yang merupakan fase diam (Stationer Phase),dan yang lainnya ialah fase gerak
(Mobile Phase).
Berdasarkan terikatnya suatu komponen pada fase
gerak,komponen-komponen suatu campuran dapat dipisahkan.komponen yang kurang
larut dalam fase gerak atau yang lebih kuat terserap atau terabsorbsi pada fase
diam akan tertinggal,sedangkan komponen yang lebih larut atau kurang terserap
akan bergerak lebih cepat.
Pada percobaan kali ini yang akan kita bahas adalah
Kromatografi Lapis tipis (KLT).
Kromatografi lapis tipis (KLT)
adalah suatu tehnik pemisahan yang sederhana dan banyak digunakan. Metode ini
menggunakan lempeng kaca atau lembaran plastik yang ditutupi penyerap untuk
lapisan tipis dan kering bentuk silika gel, alomina, selulosa dan polianida.
Untuk menotolkan larutan cuplikan pada lempeng kaca, pada dasarnya dgunakan
mikro pipet/ pipa kapiler. Setelah itu, bagian bawah dari lempeng dicelup dalam
larutan pengulsi di dalam wadah yang tertutup. (Chamber)
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
ini mirip dengan kromatograafi kertas, hanya bedanya kertas digantikan dengan
lembaran kaca tau plastik yang dilapisi dengan lapisan tipis adsorben seperti
alumina, silike gel, selulosa atau materi lainnya.
Lapisan tipis adsorben pada proses pemisahan
berlaku sebagai fasa diam. Kromatografi lapis tipis lebih bersifat
reproduksibel ( bersifat boleh diulang) dari pada kromatografi kertas.
Sebagai fasa diam dalam KLT berupa serbuk halus
dengan ukuran 5 – 50 mikrometer. Serbuk halus ini dapat berupa adsorben penukar
ion. Bahan adsorben sebagai fasa diam dapat digunakan gel, alumina, dan serbuk
selulosa. Partikel silica gel mengandung gugus hidrosil dipermukaannya
yang akan membentuk ikatan hydrogen dengan molekul – molekul pokar.
Untuk membuat lapisan tipis pada
KLT perlu dibuat bubur (slurry) ber air dari serbuk halus tadi. Zat pengikat
dapat menggunakan gips, barium sulfat, polivenil alcohol atau kanji perlu
ditambahkan, untuk membantu peletakan lapisan tipis pada penyangga. Bubuk halus
ini kemudian ditebarkan pada papan penyangga (kaca, plastik atau aluminium),
secara merata sehingga diperoleh ketebalan lapisan 0,1 – 0,3 mm. lapisan tipis
adsorben diaktifkan dengan pengeringan didalam oven pada suhu 100 oC
selama beberapa jam.
(http://robbaniryo.com/ilmu-kimia/kromatografi-lapis-tipis-klt/)
Pemisahan
campuran dengan cara kromatografi didasarkan pada perbedaan kecepatan merambat
antara partikel-partikel zat yang bercampur pada medium tertentu. Dalam
kehidupan sehari-hari pemisahan secara kromatografi dapat kita temui pada
rembesan air pada dinding yang menghasilkan garis-garis dengan jarak ternentu.
III. Alat Dan Bahan
1.
Lempeng KLT
2.
Bejana KLT
3.
Kaca arloji
4.
Etanol
5.
Mikro pipet
6.
Mistar
7.
Pensil
8.
Tissue
9.
Zat warna tunggal I (Rodamin)
10. Zat warna tunggal II (Yellow)
IV. Cara Kerja



Hitung
Rf
V. Data
Hasil Pengamatan (Perhitungan)







Keterangan:
Rf yang baik antara 0,3 – 0,7
VI. Pembahasan
Analisis
kuantitatif dengan KLT ada dua macam. Yang pertama noda cuplikan setelah
dikembangkan diukur langsung luasnya atau kerapatannya (density). Secara manual
atau menggunakan alat – alat yang disebut densitometer. Tehnik ini disebut
evaluasi ’“in one”. Luas atau kerapatan noda dibandingkan dengan kerapatan noda
senyawa standar yang telah diketahui konsentrasinya. Cara yang kedua, noda
diambil dengan cara dikerok atau diisap dengan suatu alat kemudian dilarutkan
dalam suatu pelarut dan larutan terakhir diamati dengan spectrometer UV – vis
atau ditimbang (gravimetric) setelah pelarut diuapkan. Cara gravimetric hanya
dapat dilakukan apabila jumlah cuplikan cukup besar. Cara ini tidak membutuhkan
standar pembanding
Pada percobaan ini, tehnik kromatografi
lapis tipis yang digunakan adalah suatu plat tipis (aluminium) yang
berfungsinya untuk tempat berjalannya adsorbens sehingga proses migrasi analit
oleh solventnya bisa berjalan. Hal ini Inilah yang membedakan antara
kromatografi kertas dengan kromatografi lapis tipis. Yang dimana pada KLT
menggunakan plat tipis sedangkan pada KK menggunakan kertas (lapisan selulosa)
sehingga proses elusinya lebih lama (kira – kira 10 – 20 menit lebih lama dari
KLT). Perbedaan lainnya dari kedua kromatografi tersebut adalah pembentukan
noda pada adsorbensnya dimana pada KLT noda yang dihasilkan lebih tajam
dibandingkan noda yang nampak dalam KK. Hal ini disebabkan pada KK penyusun
dari adsorbens berupa selulosa yang dapat mengikat air, sehingga ketika dielusi
dengan suatu pelarut atau fase gerak maka noda yang dihasilkan mengalami
penyebaran akibat terdapatnya gugus –OH dalam adsorbens yang masih tertingal
dalam fase diamnya sehingga penampakan nodanya terlihat lebih pudar dan bentuk
nodanya tidak bulat. Sedangkan dalam KLT adsorbens yang digunakan berupa slika
gel (SiO2) yang tidak mengikat molekul air, sehingga noda yang tercipta lebih
terfokus dan tajam.
Pada percobaan ini, didapatkan nilai
Rf yang berbeda-beda dari tiap analit. Pada penentuan nilai Rf pada zat tunggal
I & zat tunggal II secara berturut-turut adalah 0,89 , 0,625 dan Rf pada
zat warna campuran adalah 0,91 & 0,625
VII. Kesimpulan
Berdasarkan
hasil pengamatan dan pembahasan dari percobaan diatas, maka dapat disimpulkan
sebagai berikut yakni Tehnik pemisahan dengan kromatografi lapis tipis
merupakan tehnik pemisahan kromatografi planar dimana zat – zat dipisahkan
berdasarkan perbedaan migrasi solute/ zat terlarut antara dua fase (fase gerak
dan fase diamnya). Dimana fase diamnya/ adsorbensnya dilapisi dengan plat tipis
(aluminium) sebagai penunjang adsorbennya dan nilai Rf yang didapatkan adalah
nilai Rf pada zat tunggal I & zat
tunggal II secara berturut-turut adalah 0,89 , 0,625 dan Rf pada zat warna
campuran adalah 0,91 & 0,625
VIII.
Daftar
Pustaka
-
Rudi,L.
2010. Penuntun Dasar-Dasar Pemisahan Analitik. Universitas Haluoleo. Kendari
-
Buku Petunjuk Praktikum Biokimia,
Fakultas Farmasi UKWMS, 2011
Surabaya,
29 September 2011
Praktikan,
(Melia
Ivana Wijaya)